Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa / Eficiência de baixas concentrações de lipoproteínas de baixa densidade natural e liofilizada na crioproteto de espermatozoides caninos

The aim of this study was to evaluate the use of low concentrations of natural and lyophilized low density lipoprotein (LDL) from hen's egg yolk for cryopreservation of canine semen. Different ammonium sulphate concentrations were tested to extract LDL from egg yolk. The yolk was centrifuged, and LDL was isolated using 10, 20, 40, 45, or 50 percent ammonium sulphate solution (ASS). The LDL-rich floating fraction was collected for chemical characterization. Dry matter content was lowest (P<0.05) in the LDL extracted with the 50 percent ASS. The purification of LDL increased in association with increasing ammonium sulphate concentrations. SDS-PAGE showed that the 50 percent ASS solution yielded a purer fraction of LDL from egg yolk. For semen cryopreservation, TRIS extender was used replacing 20 percent egg yolk (control) by natural or lyophilized LDL using 1, 2, and 3 percent (w/v). Semen was centrifuged (755Xg for 7 min), diluted with one of the extenders, packed into 0.5mL straws (100x106 sperm/mL), and placed in a programmable cryopreservation machine. Thawed semen (37°C/ 30s) was analyzed for sperm motility, morphology, and by the hypoosmotic and epifluorescence tests (CFDA/ PI). Natural LDL extracted with 50 percent ASS was as effective as whole egg yolk to preserve canine frozen sperm when using low concentrations. The lyophilized LDL, mainly in the two higher concentrations tested (2 and 3 percent), was unsuitable to maintain the effectiveness of the LDL cryoprotective effect on dog sperm...

O objetivo deste estudo foi avaliar o uso de baixas concentrações da lipoproteína de baixa densidade (LBD) extraída da gema do ovo de galinha, nas formas natural e liofilizada, na criopreservado do sêmen canino. Diferentes concentrações de sulfato de amônio também foram testadas na extrato da LBD da gema do ovo. A gema foi centrifugada, sendo a LBD isolada usando-se soluto saturada de sulfato de amônio (SSA) nas concentrações de 10, 20, 40, 45 e 50 por cento. A frado rica em LBD foi coletada para caracterizado química. O conteœdo de matéria seca foi menor (P<0,05) na LBD extraída com SSA 50 por cento. A pureza da LBD melhorou medida que se aumentou a concentrado de SSA utilizada. SDS-PAGE mostrou que a SSA 50 por cento produziu uma frado mais pura de LBD oriunda da gema do ovo. Para o congelamento de sêmen, o meio diluidor TRIS teve a gema do ovo a 20 por cento (controle) substituída pela LBD a 1, 2 e 3 por cento (p/v), nas formas natural e liofilizada. O sêmen foi centrifugado (755xg por 7min), diluído em um dos meios diluidores em teste e envasado em palhetas de 0,5mL (100x106 sptz/mL), sendo congelado em máquina de congelamento programável. O sêmen descongelado (37°C/30s) foi analisado quanto motilidade e morfologia espermática e nos testes hiposm-tico e de epifluorescência (DACF/IP). A LBD natural extraída com SSA 50 por cento foi tão eficiente quanto a gema do ovo na preservado do espermatozoide canino congelado nas baixas concentrações testadas. A LBD liofilizada, principalmente as duas maiores concentrações (2 e 3 por cento), não foi adequada para manter o efeito crioprotetor da LBD sobre o espermatozoide canino...

Effects of kale (Brassica oleracea L. var. acephala DC) leaves extracts on the susceptibility of very low and low density lipoproteins to oxidation.

Of Brassicaceous plants, kale (Brassica oleraceae L. var. acephala DC) contains polyphenols, flavonoids, isoflavones and glucosinolates and so has antioxidant and anticarcinogenic properties. Antioxidants inhibit negative effects of free radicals and may, therefore, protect tissues against oxidative damage. Oxidation of lipoproteins is a key event in the development of atherosclerosis. In the current study, the levels of total phenolic and flavonoid contents and total antioxidant capacity of methanolic and aqueous extracts of kale leaves were determined. In addition, the susceptibility of isolated lipoproteins — very low density lipoprotein (VLDL) and low density lipoprotein (LDL) to the Cu2+-induced oxidation with various concentrations of metanolic and aqueous extracts was evaluated as t-lag values. Although aqueous extract had higher total antioxidant capacity, methanolic extract had higher total phenolic and flavonoid content (P<0.05). On the other hand, both extracts inhibited lipid peroxidation in both isolated VLDL and LDL. Inhibitory effect of extracts or increasing t-lag values, mainly in methanolic extract was found to be related to increasing the concentration of extracts. It was concluded that because of high antioxidant capacity and phenolic content, kale showed a protective effect on the oxidation of lipoproteins. Therefore, it may be speculated that kale consumption may play an important protective role in the cardiovascular and other related diseases resulting from imbalance of oxidant and antioxidant status.

Efeito de hipolipemiantes sobre a expressão de genes envolvidos no transporte reverso do colesterol / Statin effects on expression of genes involved in reverse cholesterol transport

A eficácia das estatinas em reduzir o risco de eventos coronarianos não é completamente explicada por seus efeitos em diminuir colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C). Um dos seus efeitos adicionais pode ser decorrente da modificação na concentração de lipoproteína de alta densidade (HDL), reconhecida como ateroprotetora, principalmente por seu papel no transporte reverso do colesterol (TRC). Os transportadores de membrana do tipo ATP-binding cassette, ABCA1 e ABCG1, e o scavenger receptor BI (SRBI) são proteínas importantes envolvidas no TRC e seus genes são regulados por vários fatores de transcrição, entre eles os liver-x-receptors (LXRs). Com a finalidade de avaliarmos os efeitos dos hipolipemiantes sobre expressão dos transportadores ABC e do receptor SRBI, a expressão de RNAm do ABCA1, ABCG1, SCARB1, NR1H3 (LXRα) e NR1H2 (LRXβ) foi avaliada por PCR em tempo real em células das linhagens HepG2 (origem hepática) e Caco-2 (origem intestinal) tratadas com atorvastatina ou sinvastatina (10 µM) e/ou ezetimiba (até 5 µM) por até 24 horas. Além disso, a expressão desses genes também foi avaliada em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 50 pacientes normolipidêmicos (NL) e 71 hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4semanas, n=48) ou sinvastatina e/ou ezetimiba (10mg/dia/4 ou 8 semanas, n=23). A possível associação entre os polimorfismos ABCA1 C-14T e R219K e a expressão de RNAm em CMSP também foi avaliada por PCR-RFLP. O SCARB1 foi o gene mais expresso nas células HepG2 e Caco-2, seguido por NR1H2, NR1H3, ABCG1 e ABCA1 em HepG2 ou por ABCA1 e ABCG1 em Caco-2. O tratamento com estatinas (1 ou 10 µM) ou ezetimiba (5 µM), por 12 ou 24 horas, aumentou a expressão de RNAm do ABCG1, mas não de ABCA1 e SCARB1, em células HepG2. Ainda nesta linhagem, o aumento na transcrição dos genes NR1H2 e NR1H3 foi observado somente com a maior concentração de atorvastatina (10 µM) e, ao contrário, o tratamento com ezetimiba...

The efficacy of statins in reducing the risk of coronary events is not completely explained by their effects in decreasing cholesterol low-density lipoprotein (LDL-C). One of their additional effects may result from the change in concentration of high-density lipoprotein (HDL), recognized as atheroprotective, mainly for the role in reverse cholesterol transport (RCT). The membrane transporters, as ATP-binding cassette, ABCA1 and ABCG1, and scavenger receptor BI (SRBI) are important proteins involved in the RCT and their genes are regulated by various transcription factors, including the liver-X-receptors (LXRs) . In order to evaluate the effects of lipid lowering on expression of ABC transporters and SRBI receptor, the mRNA expression of ABCA1, ABCG1, SCARB1, NR1H3 (LXRα) and NR1H2 (LRXβ) was assessed by real time PCR in HepG2 (hepatic origin) and Caco-2 (intestinal origin) cells treated with atorvastatin or simvastatin (10 µM) and/or ezetimibe (up to 5 µM) for 24 hours. Furthermore, the expression of these genes was evaluated in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of 50 normolipidemic (NL) and 71 hypercholesterolemic (HC) patients treated with atorvastatin (10mg/d/4 weeks, n = 48) or simvastatin and/or ezetimibe (10mg/d/4 or 8 weeks, n = 23). The possible association between ABCA1 C-14T and R219K polymorphisms and mRNA expression in PBMC was also evaluated by PCR-RFLP. SCARB1 was the most expressed in HepG2 and Caco-2 cells, followed by NR1H2, NR1H3, ABCG1 and ABCA1 in HepG2 or by ABCG1 and ABCA1 in Caco-2. The treatment with statins (1 or 10 µM) or ezetimibe (5 µM) for 12 or 24 hours, increased mRNA expression of ABCG1 but not ABCA1 and SCARB1 in HepG2 cells. Moreover, in HepG2 cells, atorvastatin also upregulated NR1H2 and NR1H3 only at 10.0 µM, meanwhile ezetimibe downregulated NR1H2 but did not change NR1H3 expression. In Caco-2 cells, atorvastatin or simvastatin treatment for 12 or 24 hours reduced the amount of ABCA1 transcript and did not ...

Efecto de dietas con aceites de palma, girasol o pescado: sobre la susceptibilidad a la oxidación de las lipoproteínas LDL-HDL del plasma de la rata / Effect of diets with oil palm sunflower or fish: on the oxidation of LDL-HDL lipoproteins of the rat plasma

Las modificaciones oxidativas de las lipoproteínas del plasma desempeñan un papel causal e importante en el inicio y progresión de la aterosclerosis. Los estudios in vitro indican que la velocidad y extensión de la oxidación de la LDL y HDL está influenciada por su composición de ácidos grasos. En el presente estudio se evaluó el efecto del consumo por 60 días de una dieta purificada al 10% (p/p) en los aceites de palma, girasol o pescado sobre la susceptibilidad de oxidación in vitro de las fracciones conjuntas de las lipoproteínas LDL y HDL del plasma de ratas machos Sprague Dawley. Utilizamos dos métodos para la evaluación: La determinación de sustancias reactivas con el ácido tíobarbitúrico (SRTBA) propuesto por Kosugi et al y el de determinación de peróxidos descrito por El-Saadani. Se encontró por ambos métodos que existe una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre la susceptibilidad de oxidación de las fracciones LDL + HDL de los tres grupos. El mayor grado de oxidación se observó para el grupo suplementado con aceite de pescado seguido de los grupos de girasol y palma. Esto sugiere que la incorporación de ácidos grasos monoinsaturados (oleico) en la dieta en lugar de poliinsaturados, protege las LDL + HDL de las modificaciones oxidativas al reducirse la concentración de AGPI disponibles para la peroxidación.

Oxidative modifications of lipoproteins of the plasma play a causal and important role in the beginning and progression of the atherosclerosis. Studies in vitro indicate that the speed and extension of the oxidation of LDL and HDL are influenced by its fatty acid composition. In the present study the effect of the consumption for 60 days of a diet purified containing 10 % of either palm, sunflower or fish oil were evaluated on the susceptibility to in vitro oxidation of LDL+HDL lipoproteins from the plasma of male Sprague Dawley rats. For this evaluation we performed two methods: determination of reactive substances with tiobarbituric acid (SRTBA) proposed for Kosugi et al, and the peroxides as described by Al-Saadani. It was found, by both methods, that a statistically significant difference (p < 0, 05) existed between the susceptibility to oxidation of LDL and HDL fractions for the three dietary groups. The greatest degree of oxidation was observed for the group supplemented with fish oil followed by groups of sunflower and palm. This suggests that the incorporation of monounsaturated fatty acids (oleic) in the diet instead of polyunsaturated protects the oxidative modification of LDL and HDL by reducing the concentration of PUFA available for peroxidation.

Determinación de ácido siálico sobre lipoproteínas de baja densidad aisladas por precipitación selectiva: propuesta de índices de composición / Sialic acid determination in low density lipoprotein isolated by selective precipitation: index of composition

El objetivo de éste estudio fue optimizar la determinación de ácido siálico en LDL aislada por precipitación selectiva y establecer relaciones entre componentes que puedan ser indicadores de aterogenicidad. Se empleó polivinilsulfato disuelto en polietilenglicol como reactivo precipitante, se ajustaron las condiciones de los lavados para garantizar la ausencia de otras proteínas del suero y se solubilizó la LDL en 5 por ciento de NaCI. Se determinó apoB, colesterol, proteínas y se optimizó la cuantificación de ácido siálico según el método de Warren modificado por Sobenin y col. Se realizó la evaluación del método analítico adaptado en cuanto a precisión intra- e inter-ensayos (CV 8 y 9 por ciento respectivamente), linealidad (hasta 7 nmol de ácido siálico/tubo); efecto de los lavados; especificidad; ausencia de interferencia de blancos de reactivo precipitante; ensayo de recuperación (entre 88 y 120 por ciento). Los resultados obtenidos sobre 30 muestras de personas normolipémicas de ambos sexos (edades entre 30 y 65 años) expresados como media ñ SEM fueron: colesterol 3,8 ñ 0,2 mmol/l, ácido siálico 34,7 ñ 2,7 µmol/l, ApoB 1,27 ñ 0,09 µmol/l, proteínas 1,57 ñ 0,08 g/l. Indices de composición: ácido siálico/colesterol: 9,24 ñ 0,48 mmol/mol, ácido siálico/apoB 34,4 ñ 3 mol/mol y ácido siálico/proteína 39,6 ñ 1,31 µmol/g. Son necesarios estudios clínicos que permitan evaluar los alcances de los índices de composición propuestos como posibles indicadores de aterogenicidad

Efecto de los proteoglicanos arteriales sobre la oxidación in vitro de LDL aislada de pacientes hipercolesterolémicos / Effect of arterial proteoglycans on in vitro oxidation of LDL isolated from hypercholesterolemic patients

The interaction of LDL with extracellular matrix proteoglycan apparently contribute to the acumulation of apo B-lipoproteins in atherogenesis. Retention of LDL by intima proteoglycans appears to increase the residence time needed for their structural, hydrolytic and oxidative modification. If the rate of LDL entry exceeds the tissue capacity to eliminate the modified products, this process may contribute to atherogenesis. In this study we explored whether alterations of LDL induced by human arterial CSPG alter the lipoprotein susceptibility to copper-catalyzed oxidation. Human LDL was complexed with human arterial CSPG and dissociated by raising the ionic strength. The CSPG-treated LDL was subjected to oxidation by micromolar amounts of copper. This treatment increased LDL susceptibility to oxidation 8 times, as indicated by formation rates of thiobarbituric acid-reacting substances (TBARS). Furthermore, the hypercholesterolemic patients show LDL with significantly higher affinity for arterial proteoglycans than LDL from controls.

Predisposicion a la oxidacion in vitro de la LDL aislada de pacientes con hipercolesterolemia. Interaccion con proteoglicanos arteriales / Predisposition to in vitro oxidation of LDL isolated from hypercholesterolemic patients. Interaction with arterial proteoglycans

Se ha demostrado que existe una correlación positiva entre la ateroesclerosis y los niveles elevados de colesterol plasmático. Estudios recientes han permitido estabelecer nuevos factores que podrían estar involucrados en el proceso aterogénico como sería la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la estructura de la lipoproteina de baja densidad (LDL) que las haría potencialmente más aterogénicas. Paralelamente, hay evidencias que indican que la interacción de la LDL con componentes de la matriz extracelular de la íntima arterial, específicamente con proteoglicanos, podría contribuir a la acumulación de esta lipoproteina durante el proceso aterogénico. En el presente trabajo se exploró la susceptibilidad a la oxidación de la LDL aislada de pacientes hipercolesterolémicos y los resultados obtenidos sugieren que esta lipoproteina tiene mayor predisposición a la oxidación y además estas LDL mostraron una mayor afinidad por proteoglicanos arteriales aislados de íntima-media de aorta humana.

Producción de los reactivos primarios de un sistema inmunoenzimático ELISA para determinar lipoproteína (a) / Production of primary reactives of an ELISA immunoenzymatic system to determine lipoprotein (a)

El objetivo de nuestro trabajo fue desarrollar la metodología y la producción de los reactivos primarios para realizar un método inmunoenzimático (ELISA) tipo sandwich para determinar lipoproteina (a) en suero humano. La concentración final del antisuero policlonal antiapolipoproteína (a) (anti-apo [a]) obtenida fue de 1,3 mg/dL, purificado, por cromatografía de afinidad y de intercambio iónico. El antisuero antilipoproteína de baja densidad (anti LDL) de carnero purificado por cromatografía de afinidad fue utilizado en la obtención del conjugado policlonal perxodasa-IgG anti-LDL. La concentración óptima de recubrimiento con anti-apo (a) fue de 2 µg/mL y la dilución óptima del conjugado fue 1/7000, con lo cual obtuvimos una sensibilidad alta del ensayo. Poder producir en nuestro laboratorio reactivos primarios para el desarrollo de un sistema inmunoenzimático de determinación de Lp (a) hace posible la accesibilidad de la determinación con fines asistenciales e investigativos, así como un ahorro en moneda libremente convertible, pues estos reactivos tienen un elevado costo en el mercado

Contribución del músculo esquelético al catabolismo de las hipoproteínas de muy baja densidad en la rata hipotiroidea / Contribution of skeletal muscle at catabolisal of the high density lipoprotein in hypothyroid rat

Se estudia la participación del músculo esquelético de ratas hipotiroideas y controles en el catabolismo de la VLDL, a través de la composición química de la VLDL e IDL post-lipólisis obtenidas por perfusión del tren posterior de la rata. Se hicieron cuatro estudios: en el estudio I se caracterizaron las VLDL e IDL plasmáticas nativas en ratas hipotiroideas y controles. El grupo formado por 6 "pools" formado por plasmas proce-entes de 3 a 5 ratas en cada pool. El grupo control se formó con 8 "pools" de plasmas procedentes de lotes de 3 a 5 ratas cada uno. El estudio II se basó en la perfusión del tren posterior de ratas hipotiroideas y controles con VLDL y la posterior caracterización de las VLDL post-lipólisis y las IDL obtenidas; haciéndose 8 perfusiones, entre las cuales 4 eran del grupo hipotiroideo y 4 al grupo control. El estudio III se perfundieron VLDL de ratas hipotiroideas o normales en músculos provenientes de ratas en ambas condiciones metabólicas. Se hicieron 12 perfusiones: 6 correspondientes a la perfusión con VLDL de rata normal: 3 se realizaron en el músculo de las ratas hipotiroideas y 3 en el músculo de las ratas del grupo control. Y 6 correspondientes a las perfusiones con VLDL de rata hipotiroidea, 3 de las cuales se realizaron perfundiendo el músculo de ratas hipotiroideas y 3 en las ratas controles. Elestudio IV se hizo camparando los resultados del estudio I y II; los resultados del estudio de las lipoproteínas nativas, revelan que las VLDL hipotiroideas difieren en relación a las controles por su menor contenido de TG y por su mayor proporción de proteinas totales..